CÁCH MẠNG KỸ THUẬT SINH HỌC
Phần 5. KỸ THUẬT BIÊN TẬP HỆ-GEN

   Biên tập hệ-gen (genome editing) là một diễn trình biên tập DNA của sinh vật bằng cách biến đổi, cắt bỏ. hay ghép thêm nucleotides vào hệ-gen. Diễn trình này hoàn thành nhờ vào công nghệ sử dụng enzyme nuclease làm cặp đôi DNA bị cắt xén hay sợi đơn DNA bị sứt mẻ một mãnh nhỏ ở vị trí mong muốn. Những vị trí DNA này bị biến đổi và được sửa chữa bằng tái-tổ-hợp gen đồng-hợp-tử hay dị-hợp-tử. Công nghệ biên tập hệ-gen rất hữu ích cho nhiều ứng dụng, như tạo đột-biến gen mong muốn, xắp xếp lại nhiễm thể và tạo sinh vật biến đổi gen.
   Trong công nghiệp sinh học, các nhà khoa học dựa trên tính đột-biến (mutation) để biết vị trí của gen trong hệ-gen và xác định bản chất của gen trong việc sản xuất protein đặc thù, và tìm hiểu các bệnh liên quan do gen chi phối. Với phương pháp cổ điển để tạo chuột mang đột biến ở nhiều gen, các nhà khoa học sử dụng phương pháp tái-tổ-hợp DNA ở tế-bào-phôi chuột, rồi sau đó cho lai với chuột có đột biến. Mặc dầu đây là một phương pháp rất chính xác nhắm vào gen, nhưng vì dựa trên lai tạo nên phải mất nhiều năm và rất tốn kém.
Hiện tại có rất nhiều kỹ thuật cách mạng nhắm vào gen mục tiêu rất chính xác, hữu hiệu, nhanh chóng và ít tốn kém hơn để biên tập hệ-gen, trong số này 3 phương pháp thông dụng và quan trọng là ZFN, TALEN và CRISPR.
ZFN (Zinc finger nucleases) là phương pháp đầu tiên được công bố năm 1991 và được sử dụng trong khoảng 10 năm cho tới khi kỹ thuật mới hơn là TALEN ra đời. ZFN là một protein nhỏ có khoảng 30 amino acid chuẩn, chúng tương tác với trinucleotide. Trinucleotide là một nucleotide cấu tạo bởi 3 mononucleotide, là một dạng không bền vững, và là nguồn gốc bệnh X-syndomes và X-E syndromes. ZNF được thiết kế để nhận diện được 64 tổ hợp trinucleotide. ZFN lả một dụng cụ mãnh liệt trực tiếp làm biến đổi trình tự DNA của hệ-gen bằng cách nhắm mục tiêu gen và chia đôi trình tự gen mục tiêu.
ZFN rất hữu hiệu trong việc sửa đổi hệ-gen của nhiều thảo mộc và thú như đã thực hiện ở cải arabidopsis, thuốc lá, đậu nành, bắp, ruồi trái cây Drosophyla, hải sâm, tằm (nhả tơ), cá sọc rằng zebrafish, ếch, chuột, thỏ, heo vả bò. Chẳng hạn ở bò tạo sữa biến đổi protein, heo cho tim ghép vào người mà không bị sa thải. Ngoài ra, để chữa trị HIV ở người, các nhà khoa học dùng kỹ thuật ZFN làm biến đổi gen CCR5 là gen chủ động phát triển bệnh HIV.
TALEN (Transcription activator-like effector nucleases) tương tự như ZFN, dùng enzyme nuclease DNA để chia đôi hệ-gen tại một địa điểm mong muốn. Nuclease là một enzyme làm tách rời các nucleotides. Khác với ZFN nhận diện bộ ba trinucleotide, còn TALEN nhận diện một nucleotide đơn tức mononucleotide. TALEN trở thành một công cụ để tách rời hai nucleotides quấn nhau tại một vị trí mong muốn trên DNA.
TALEN ra đời năm 2009, và được bình chọn là “Kỹ thuật của năm 2011”, vì tính chính xác, nhắm đúng mục tiêu.
TALEN rất hữu hiệu làm biến đổi hệ-gen thực vật, tạo nhiều giống có chất dinh dưỡng cao, cũng dùng để cải thiện cây sản xuất xăng sinh học. TALEN cũng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp biến đổi bền vững hệ-gen của tế-bào-phôi người, tạo tế-bào-phôi-đa-năng IPSC (phần 6), và đường dây tế-bào-gốc hồng huyết cầu (erythroid) của người.
TALEN cũng đang được thử nghiệm để sửa chữa một số bệnh di truyền như sickle cell (bệnh hồng huyết cầu), xeroderma pigmentosum (bệnh cảm nhiễm ánh nắng đưa đến ung thư da) và epidermolysis bullosa (da dễ vỡ, nứt làm chảy máu). Cũng trong thời gian vừa qua, TALEN cũng áp dụng để tăng cường hệ miễn nhiễm chống ung thư.
CRISPR - viết tắt từ “Clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, tạm dịch “Cụm gen phân đoạn đều bởi hàng mã số ngược xuôi được lập đi lập lại” – là những đoạn DNA chứa các trình tự base ngắn lập đi lập lại thấy ở vi sinh vật đơn-bào-không-nhân (Prokaryotes) như vi khuẩn.
Kỹ thuật CRISPR được khám phá bởi 3 nhóm nghiên cứu sinh học độc lập trên thế giới, năm 1987 tại Osaka University (Nhật), năm 1993 tại Hòa Lan và tại University of Alicante (Spain). Năm 2012, kỹ thuật CRISPR đạt đỉnh cao với cách hoàn thiện nhiều khả năng tuyệt vời đáng kinh ngạc.
Bởi vì DNA được cấu tạo bởi hai sợi nucleotides quấn ngược chiều theo hình xoắn ốc (xin đọc lại tài liệu 3). Mỗi nucleotide gồm có: một chất đường-chứa-năm-carbon, một nhóm phosphate, và một trong bốn bases là adenine (A), cystosine (C), guanine (G) và thymine (T). Nơi kết nối của 2 sợi DNA là một cặp-base (base pair) và lúc nào A cũng đi chung với T; và C đi chung với G. Một trình tự nucleotide (trên 1 sợi đơn) được gọi là ngược xuôi (palindrome) nếu chúng bằng nhau và giống nhau khi đọc theo chiều ngược lại.
Ví dụ, Enzymes EcoR1 ở Escherichia coli gồm có 2 chuỗi bases nằm trên 2 sợi nucleotides:
                             5'- G A A T T C -3'
                             3'- C T T A A G -5'
 
   Nếu đọc ngược (từ phải sang trái) của hàng trên thì y hệt chuỗi bases của hàng dưới (đọc xuôi), và nếu đọc ngược lại ở hàng dưới thì giống y hệt trình tự ở hàng trên.
Bởi vì vi khuẩn có một hệ thống miễn nhiễm rất hoàn hảo, khi bị một virus xâm nhập tấn công, hệ thống miễn nhiễm của vi khuẩn tìm cách truy lùng, bắt DNA của virus thù địch, rồi nhốt vào hệ thốngCRISPR của vi khuẩn dưới hình thức một đoạn cách-ly (spacer).
   Như vậy, mỗi lần bị virus tấn công, một đoạn cách-ly ngắn chứa DNA xa lạ của virus, tạo thành một cụm nhỏ của hệ thống phối hợp gen cas (CRISPR-associated system) nằm kế bên trình tự CRISPR, mang tên hệ thống CRISPR/cas.
   Năm 2005, ba nhóm nghiên cứu độc lập trên thế giới (Nhật, Hòa Lan và Spain) cho biết các khoảng cách-ly CRISPR có xuất xứ từ DNA ngoại lai, tương tự như plasmids của vi khuẩn (xin đọc lại tài liệu 3). Sự hiện diện của đoạn cách-ly là dấu hiệu của hệ thống CRISPR/casđóng vai trò của hệ miễn nhiễm của vi khuẩn.
    Chính hệ thống CRISPR/Cas là một hệ thống miễn nhiễm ở vi sinh-vật-đơn-bào-không-nhân để kháng cự lại với tác nhân ngoại lai như virus hay vi khuẩn khác gây bệnh. Chính nhờ RNA chứa chấp trình tự đoạn cách-ly nên giúp hệ thống Cas nhận diện được DNA ngoại lai để cắt bỏ tiêu diệt. Một hệ thống khác là protein RNA-hướng dẫn Cas (RNA-guided Cas) cắt bỏ tiêu diệt RNA ngoại lai.
   Hệ thống CRISPR được tìm thấy trong 40% trình tự hệ-gen của vi khuẩn, và 90% ở trình tự siêu-vi-khuẩn. Tới nay, tường trình cho biết có 93 gen cas phân loại thành 35 tộc dựa vào sự giống nhau các trình tự mã hóa protein. Ngoài ra tường trình cho biết có ít nhất 25 hệ thống CRISPR/cas hiện diện trong hệ miễn nhiễm ở các loài vi khuẩn hay siêu vi khuẩn khác nhau.
Một hệ thống CRISPR giản đị nhất được nghiên cứu nhiều và áp dụng nhiều là CRISPR/cas9 từ vi khuẩn Streptococcus pyogenesdựa vào protein Cas9.
Cách hoạt động của CRISPR
   CRISPR có khả năng săn lùng tìm kiếm mục tiêu, bắt địch thủ, vô hiệu hóa địch, tiêu diệt địch bằng cách cắt bỏ. Nó còn có khả năng sao chép (copy), cắt bỏ (cut) và dán (paste), cũng như biên tập (edit).
   Làm cách nào hệ thống CRISPR/Cas9 chuyển gen lạ vào DNA của tế bào mục tiêu? Trước nhất, các nhà sinh học vận dụng crRNA (tứcCRISPR RNA) và tracrRNA (tức tran-activating crRNA) thành mộtsgRNA (tức RNA-hướng-dẩn, single-guide RNA), rồi kết hợp vớigen Cas9 để đưa vào hệ plasmid của vi khuẩn (xem lại Phần 4). Giai đoạn kế tiếp là sử dụng plasmid này để chuyển đoạn gen Cas9 vào DNA của tế bào mục tiêu, nhờ protein Cas9 nhận diện được DNA mục tiêu, rồi đính chặc vào DNA đó.
   Hệ thống CRISPR/Cas9 có khả năng cắt bỏ gen của một hệ-gen khi sử dụng phiên bản “chết” (dead) dcas9 để loại bỏ đoạn gen xấu và giữ đoạn gen tốt. Chẳng hạn có thể cắt 5 đến 62 gen cùng một lúc để vô hiệu 62 gen gây bệnh di truyền ở heo, bởi vì khi ăn thịt heo bị bệnh này con người cũng sẽ nhiễm bệnh của heo.
   Hệ thống CRISPR/Cas9 còn có khả năng làm vô hiệu hóa (off) hay kích hoạt (on) bất cứ gen nào. Cas9 còn được sử dụng để mang các yếu tố chuyển mã nhân tạo để kích hoạt gen ở người để chữa trị hay ngăn ngừa một số bệnh tật.
   Tóm lại, CRISPR/Cas9 là một phiên bản biến đổi dùng để biên tập hệ-gen. Bằng cách biến đổi trình tự nucleotides của RNA hướng dẫn (guide RNA), hệ thống ca9 nhân tạo này có thể được lập trình để tìm mục tiêu. Khi chuyển giao Cas9 kết hợp với RNA-hướng-dẫn (gRNA) nhân tạo vào tế bào, hệ-gen của tế bào bị cắt ở đoạn mong muốn, loại bỏ đoạn gen (xấu) đó, và thay thế bằng đoạn gen mới để tạo một hệ-gen mới có chứa gen (tốt) mong muốn. Như vậy,CRISPR là một kỹ thuật xén bỏ đoạn gen xấu rồi nhét (insert) những trình tự DNA mới, hay cả toàn thể gen tốt, vào hệ-gen một cách chính xác.
   Năm 2003, kỹ thuật tiến bộ thêm một bậc nữa là khả năng tự nhân phiên bản (copy) gen mong muốn của nhiễm thể này để chèn vào nhiễm thể khác.
Áp dụng của kỹ thuật CRISPR
   Các nghiên cứu của Đại học Harvard dùng kỹ thuật CRISPR/Cas9áp dụng vào tế bào để biên tập hệ-gen ở người. Về sau, áp dụng vào nhiều sinh vật khác như men bánh mì Saccharomyces cerevisiae, cá sọc rằn (zebrafish, D. rerio), ruồi trái cây (fruit flies, Drosophila melanogaster), tuyến trùng (nematodes, C. elegans), cây hoa màu, chuột, khỉ và phôi người.
   Năm 2012, công nghiệp sinh học đã áp dụng CRISPR/cas9 vào việc gây miễn nhiễm cho một số vi khuẩn quan trọng trong ngành thực phẩm và vi khuẩn lên men.
   Vào cuối năm 2014, khoảng 600 tường trình khoa học có đề cập đến kỹ thuật CRISPR, theo đó kỹ thuật này áp dụng để vô hiệu hóa một số gen gây bệnh di truyền ở người, biến đổi men hữu hiệu để sản xuất nhiên liệu sinh học, cải thiện giống hoa màu qua biến đổi gen (GMO), tiềm năng biến muổi không còn khả năng gây bệnh sốt rét hay bệnh zika.
  Kỹ thuật CRISPR cũng được sửa đổi, cải thiện để lập trình việc sao chép cho phép các khoa học gia tìm mục tiêu, kích hoạt hay làm câm những gen mình muốn.
   Kỹ thuật CRISPR/Cas biên tập hệ-gen có nhiều tiềm năng áp dụng cho y học và cải thiện giống cây hoa màu. Kỹ thuật này đã dược Hiệp Hội Cho Tiến Bộ Khoa Học Hoa Kỳ (The American Association for the Advancement of Science, AAAS) chấp thuận năm 2015.
Năm 2015, các nhà sinh học Hoa Kỳ dùng CRISPR để tạo đột-biến-theo-phản-ứng–dây-chuyền MCR (mutagenic chain reaction), chẳng hạn tạo trong phòng thí nghiệm ruồi trái cây Drosophila có sắc tố. Thông thường, bất cứ đột biến nào cũng có 50 - 50% cơ may được chuyễn qua đời con vì phân nửa các genes đến từ mẹ, nửa phần kia đến từ cha. Nhóm sinh học sử dụng kỹ thuật CRISPR để bảo đảm là đột biến họ nhét vào một bản sao chép của nhiễm thể ruồi sẽ tự động lan tràn qua bản sao kia, đây là một tiến trình mang tên là phản-ứng-dây-chuyền đột biến gen –MCR.



Hình 1. Con lăn quăn muỗi sốt rét Á Châu Anopheles stephensimang mầm bệnh sốt rét (trái), sau khi xử lý với CRISPR để loại bỏ gen mang mầm bệnh (màu vàng ở đầu, bên phải). Con muỗi từ lăn quăn xử lý CRISPR thả ra ngoài thiên nhiên, sẽ tạo một chủng loại muỗi không còn truyền bệnh sốt rét.
 
    Một nhóm nghiên cứu khác tạo loài muỗi ở các đời sau có gen ngăn ngừa muỗi không mang tác nhân bệnh sốt rét. Vài tuần sau đó, nhóm này tuyên bố tạo được gen bất thụ ở muỗi cái, có khả năng tiêu diệt loài muỗi vì chúng không còn khả năng đẻ trứng sanh con được.
Tương tự, MCR có thể biến đổi toàn thể dân số của loài động vật qua dục tính bất thụ trong vòng vài tháng. Chẳng hạn, tiêu diệt loài sâu bọ tai hại mùa màng hay ruồi muổi, để chúng không làm lan tràn các bệnh chết người, tỷ như sốt rét, chikungunya, West Nile virus, và Zika.
  Các nhà sinh học còn khai thác RNA-hướng-dẫn "RNA-guided nucleases" của hệ thống CRISPR/Cas để tiêu hủy gen mã hóa kháng thuốc trụ sinh ở virus, như hủy diệt được tính kháng trụ sinh ở virus, cũng như vô hiệu nhiều loại gen gây bệnh ở người như đau bắp thịt, ung thư, viêm và hồng huyết cầu hoại tử. Các nhà sinh học thành công tiêu diệt được độc tính virus EBV (Epstein-Barr virus) là tác nhân ở tế bào bướu ung thư, giúp nạn nhân ghép thận, tim giữ được các cơ quan ghép này không bị loại ra khỏi cơ thể, ngăn ngừa bệnh đau cuống họng do cảm, giúp mắt tránh bị nhiễm trùng nhờ ngăn chận được vi khuẩn HSV-1.
   Kỹ thuật CRISPR cũng làm hồi sinh lại kỹ thuật ghép cơ quan nội tạng của thú vào người. Retrovirus ở thú ngăn cản việc ghép tim thú vào con người. Năm 2015, các nhà sinh học thành công loại được 62 nhân bản của retrovirus DNA trong hệ-gen của heo. Tương tự, CRISPR áp dụng kỹ thuật cấy mô tế bào như tạo mạch máu ở người không chứa gen MHC class II, gen này làm cơ thể trục xuất cơ quan lạ khi ghép vào cơ thể.
   Mới đây nhất (2015 - 2017), CRISPR được sử dụng để nghiên cứu tế-bào-gốc-phôi-người. Ít nhất trên thế giới hiện có 4 phòng thí nghiệm (2 ở Hoa Kỳ, UK và China) nghiên cứu áp dụng CRISPR vào phôi người, đặc biệt cho mục đích y học (Bởi vì bị chống đối dữ dội, nhất là bởi các nhà lãnh đạo tôn giáo, với dự án tạo con người nhân tạo). Trong chiều hướng y học, một số bệnh hiểm nghèo như bệnh-ưa-chảy-máu (hemophylia), hóa-xơ-u-nang (cystic fibrosis) hay hàng chục bệnh nang y khác do di truyền được nghiên cứu để loại trừ một số gen mã hóa các bệnh này ngay trên tế bào phôi người. Tháng 4 năm 2015 một nhóm nhà khoa học Tàu đang nghiên cứu việc biến đổi DNA trong phôi chết ở người với kỹ thuật CRISPR để sửa đổi một đột biến gây bệnh beta thalassemia làm chết người. Tháng 4/2016, cũng nhóm nghiên cứu Tàu này tuyên bố là không thành công trong việc sửa chữa gen CCR5 làm phôi người đề kháng HIV.
Các nhà khoa học Tàu ở Côn Minh đã trình diện một con khỉ được tạo sinh bằng cách sửa đổi phôi bào bằng kỹ thuật CRISPR.
   Hiện tại đã có những sinh vật mới được biến cải bằng CRISPR như gà, bò thịt, nấm, lúa mì, cá tra và cá cảnh vàng (koi). Các nhà khoa học Nhật dùng kỹ thuật CRISPR khóa gen làm trái cà chua không chín ủng. Tương tự, các nhà khoa học Tàu thành công xóa bỏ 3 gen ở lúa mì làm giống này kháng được bệnh mildew.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÁNH
1.Wikipedia. CRISPR. https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR
2. Wikipedia. Transcription activator-like effector nuclease.https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_activator-like_effector_nuclease
3. Wikipedia. Zinc finger nuclease. https://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger_nucleases
4. Michael Specter (2016). How the DNA Revolution Is Changing Us. National Geographic Magazine.http://www.nationalgeographic.com/magazine/2016/08/dna-crispr-gene-editing-science-ethics.html
5, Trần Đăng Hồng (2013). Sinh vật biến đổi gen. Phần 2. Đại cương về di truyền học. Khoa học net ngày 26/2/2013.
6. Trần Đăng Hồng (2017). Cách mạng kỹ thuật sinh học. Phần 3. Kỹ thuật chuyển gen. Khoa học Net.
 
Xem tiếp phần 6 – Tế-bào-gốc