CÁCH MẠNG KỸ THUẬT SINH HỌC
    Trần Đăng Hồng, PhD
    Phần 2. ĐÁNH-DẤU-PHÂN-TỬ & ĐÁNH-DẤU-DI-TRUYỀN
 
    Đánh-dấu-phân-tử (molecular marker) và đánh-dấu-di-truyền (genetic marker) cũng chỉ là một, chỉ khác nhau ở chỗ từ đánh-dấu-phân-tử có nghĩa tổng quát dành cho nguồn gốc DNA, còn đánh-dấu-di-truyền dành cho một vùng của DNA. Đánh-dấu-phân-tử hàm chứa thông tin về các chứng bệnh rối loạn di truyền, về phả hệ dòng tộc và lịch sử tiến hóa của sinh vật. Đánh-dấu-di-truyền được áp dụng để chẩn đoán một số bệnh rối loạn di truyền do nhiễm thể liệt tính quy định như xơ nang (cystic fibrosis), xác định dòng tộc, hay căn cước DNA cá nhân.
Đánh-dấu-di-truyền. Năm 1923, Sax là người đầu tiên tường trình sự liên hệ giữa kích thước hạt đậu với màu sắc của vỏ hạt đậu. Năm 1935, Rasmusson chứng minh có sự liên-kết-di-truyền giữa thời kỳ ra hoa đậu pea với gen di truyền chi phối màu hoa đậu pea. Nghĩa là hai đặc tính này đi chung với nhau.
    Hiện tượng liên-kết-di-truyền (genetic linkage) là khuynh hướng của các trình tự DNA (tức gen) nằm ở những vị trí kề cận nhau trên cùng nhiễm thể, nên các gen chi phối đặc tính đi chung với nhau trong lúc phân chia tế nào (phân bào, meiosis). Hai gen trên cùng một nhiễm thể càng ở gần nhau thì càng dễ liên kết với nhau (Hình 1, trái). Hai gen ở trên hai nhiễm thể thì không bao giờ liên kết (Hình 1, giữa). Hai gen ở trên cùng một nhiễm thể nhưng ở vị trí rất xa nhau thì cũng không liên kết (Hình 1, phải).
 

Hình 1. Hai gen nằm trên cùng một nhiễm thể càng ở gần nhau thì càng dễ liên kết với nhau (trái), nếu ở thật xa nhau thì không thể liên kết (phải), còn nếu ở trên hai nhiễm thể khác nhau thì không bao giờ liên kết (giữa).
   Từ sự kiện khám phá đặc tính liên kết này, đã đưa đến kỹ thuật “Đánh-dấu-gen” còn gọi “đánh-dấu-phân-tử” (molecular marker), “Điềm-chỉ-DNA” (DNA fingerprinting, hay “sắc-diện-DNA” (DNA profile) để có thể vẻ bản đồ hàng ngàn gen, trong đó một đặc tính di truyền do một hay nhiều gen chi phối. Nhờ phương pháp này người lai tạo dễ dàng tìm kiếm được trong cộng đồng những cây nào có đặc tính muốn tuyển chọn, qua cách tuyển lựa trong phòng thí nghiệm ở nhóm gen liên kết, chứ không quan sát bằng mắt qua hình thái như ở lai-tạo cổ điển.
Có thể phân chia kỹ thuật đánh-dấu-phân-tử làm 2 nhóm; (i) đánh-dấu-sinh-hóa (biochemical marker) tức khám phá những biến thiên của sản phẩm do gen sản xuất như protein và amino acid; và (ii) đánh-dấu-phân-tử tức khám phá những biến thiên ở DNA như biến thiên nucleotide, chẳng hạn đoạn gen bị xóa, hay được sao chép, hay gen bị đảo ngược hay có thêm đoạn gen mới. Chỉ dấu mới của gen có thể biểu hiện ở 2 tính cách di truyền, hoặc ưu tính/liệt tính hoặc đồng-ưu-tính.
MAS. Kỹ thuật “Đánh dấu gen để tuyển chọn” (Marker assisted selection, MAS) là một tiến trình tuyển chọn gián tiếp, theo đó một đặc tính cho là tốt được tuyển chọn dựa trên việc đánh dấu (theo hình dạng, sinh hóa hay biến đổi DNA/RNA) có tính liên kết với đặc tính tốt khác như năng suất, chống sâu bệnh, chịu đựng môi trường khắt khe, phẩm chất cao. Bởi vì các gen liên kết chi phối nhiều đặc tính nằm kế cận nhau trên dây nhiễm thể, hể khi đoạn nhiễm thể này được chuyển vào một hệ gen mới thì tất cả các gen kế cận đó được mang theo (Hình 1). Kỹ thuật đánh dấu gen MAS được áp dụng vào việc lai tạo ỡ thực vật và động vật.
    Có một số gen quy định những đặc tính tốt như kháng bệnh, hạt phấn bất thụ, tự bất thụ, hình dạng cây, v.v. khó tìm thấy bằng phương pháp tuyển chọn thông thường. Tuy nhiên, những đặc tính tốt này thường liên kết với vài đặc tính khác dễ nhận thấy như xuất hiện ở dạng hình (như màu sắc ở vỏ hạt, ở hoa), hóa chất, biến đổi DNA/RNA), v.v.
Ví dụ, việc tìm kiếm cây có tiềm ẩn nhiễm bệnh nào đó mà mắt ta chưa hay không nhận thấy trước được. Bởi vì đặc tính nhiễm bệnh này do allele chi phối, vì vậy dùng kỹ thuật đánh dấu gen để tìm allele đó có hay không. Dựa vào đó, có thể biết được vị trí gen kháng bệnh này trên bản đồ hệ-gen.
    Chẳng hạn, muốn sử dụng kỹ thuật MAS để tuyển chọn cây hoa màu có tính kháng bệnh thì dựa vào việc đánh dấu allele liên kết với tính kháng bệnh để chọn nhóm gen liên kết đó.
Bệnh cháy đọt lúa mì do Fusarium là bệnh nguy hại nhất, tuy nhiên có vài giống có tính kháng bệnh này. do một gen qui định. Trước kia, muốn đưa gen đề kháng bệnh Fusarium này vào một giống tốt, các nhà lai tạo cổ điển cho lai giữa giống có gen đề kháng này với giống muốn tuyển chọn, và theo dõi sự phân ly ở các thế hệ sau để tuyền giống mới, tốt, mang tính đề kháng. Phương pháp lai tạo cổ điển mất rất nhiều năm mới có 1 giống tốt. Ngày nay, với kỹ thuật tuyển chọn MAS, ta biết gen này nằm ở đâu trên dây nhiễm thể vì gen này có tính liên-kết với gen mà ta đã biết vị trí. Dùng kỹ thuật chuyển gen đưa gen đề kháng thẳng vào nhân tế bào mà không cần kỹ thuật lai giống, nên tiết kiệm nhiều thời gian và hiệu quả nhanh chóng hơn (Xem phần 3).
 

 
Hình 2. Gen Bt của vi khuẩn Bacillus thuringiensis nằm kế bên gen chỉ dấu (màu đỏ). Dùng các kỹ thuật chuyển gen (phẩn 3), hay cắt dán (phần 5) đoạn gen này để chuyển vào hệ-gen của bông vải giúp cây bông vải đề kháng nhiều loại côn trùng.
 Đánh-dấu-phân-tử (Molecular Marker). Trong ngành di truyền học, mục đích của kỹ thuật đánh-dấu-phân-tử (hay đánh-dấu-di-truyền) là xác định một đoạn DNA ở một vị trí nào đó trên nhiễm thể trong hệ gen, thường được sử dụng trong ngành sinh học phân tử và công nghiệp sinh học, cũng được áp dụng nhiều nhất trong y học. Chẳng hạn, một trình tự DNA làm chỉ dấu để chẩn đoán bệnh di truyền rối loạn xơ-nang (cystic fibrosis), chẩn đoán các chứng bệnh rối loạn thần kinh như bệnh lú lẫn (Alzheimer), hay qui định tính liên hệ huyết thống (như cha con có cùng chung một đoạn DNA giống nhau), liên hệ vùng miền (bởi vì ở mỗi địa phương, con người có cùng chung một loại DNA đặc thù). Trong ngành thực vật, kỹ thuật đánh-dấu-phân-tử dùng để xác định tính liên hệ dòng tộc (phylogenetics) hay tính liên đới với môi trường (bởi vì ở mỗi môi trường, cây sản xuất một loại protein đặc thù).
 Họa đồ chỉ-dấu-di-truyền (mapping of genetic markers). Để thực hiện được các chẩn đoán bệnh hay liên hệ dòng tộc nói trên cần đến kỹ thuật họa đồ chỉ dấu di truyền, tức vị trí của chỉ dấu trên một dây nhiễm thể, và nhiễm thể này ở vị trí nào trong hệ gen (vì con người có 23 cặp nhiễm thể). Thứ nhì, là chỉ dấu di truyền này có liên kết với đặc tính mong muốn hay không, vị trí gần hay xa.
 Chỉ dấu DNA (DNA fingerprinting), còn gọi DNA profiling (sắc diện DNA), DNA testing (Thử nghiệm DNA), hay DNA typing là một phương pháp thử nghiệm pháp y tìm danh tánh thủ phạm qua dấu vết DNA để lại tại hiện trường như vết máu, sợi tóc hay tinh dịch, v.v. Kỹ thuật chỉ dấu DNA được Alec Jeffreys của Đại Học Leicester (Anh) phát triển để tìm sự liên hệ máu mủ hay thủ phạm. Ngày nay, phương pháp cách mạng kỹ thuật này được áp dụng khắp thế giới trong lãnh vực pháp y hình sự, và cũng áp dụng trong ngành động vật, thực vật và nông nghiệp.
 Dự án hệ di truyền con người (Human genome project). Đây là một dự án quốc tế gồm rất nhiều quốc gia (Mỹ, Anh, Nhật, Pháp, Đức, Canada, Trung quốc) tham gia do Hoa Kỳ đề xướng năm 1984, chính thức hoạt động năm 1990, và hoàn thành năm 2003. Mục đích của dự án là trình tự hóa và xác định tất cả khoảng 3 tỉ đơn vị hóa học do gen chỉ đạo di truyền, tìm nguồn cội di truyền của bệnh tật và phát triển liệu pháp chữa trị, nhất là ung thư và tiểu đường. Đây là một dự án rất lớn, vì có tới 3,3 tỉ cặp base. Dự án cũng khám phá ở người có 22.300 gen chỉ định sản xuất protein đặc thù.
Ngoài bản đồ hệ di truyền con người, cũng đã thực hiện hệ di truyền ở chuột, ruồi trái cây, con giun, v.v.
   Về thực vật, đã hoàn tất bản đồ hệ di truyền của lúa, bắp, kê, đặc biệt chi tiết với cải Arabidopsis thaliana vì là cây mẫu trong nghiên cứu di truyền ngành thực vật, tương tự như ruồi Drosophile trong ngành động vật.
 
 Các kỹ thuật đánh-dấu-di-truyền
Để hổ trợ và hoàn thiện kỹ thuật đánh-dấu-di-truyền, nhiều kỹ thuật lần lượt ra đời, thông dụng gồm:
- RFLP (Restriction fragment length polymorphism) dùng phân tích biến thiên RFLP trong bộ di truyền, là dụng cụ chánh trong bản đồ bộ gen và xác định vị trí gen gây bệnh.
- SSLP (Simple sequence length polymorphism) dùng để phân loại sự khác biệt di truyền giữa các chủng tộc, hay các vùng khác nhau có cùng chủng tộc đó.
- AFLP (Amplified fragment length polymorphism) dùng trong kỹ thuật chỉ dấu DNA (DNA fingering) và công nghệ sinh học. AFLP thông dụng trong việc xác định biến đổi di truyền trong một dòng hay liên hệ máu mủ gần ở thực vật, nấm, thú vật, vi khuẩn. Cũng dùng để xác định cha con, thủ phạm hình sự.
- Chỉ dấu RAD (RAD markers - Restriction site associated DNA markers) do Đại học Oregon phát triển năm 2006. Đây là một loại đánh dấu gen áp dụng trong bản đồ gen, di truyền tập đoàn, di truyền môi sinh và tiến hóa.
- SSR (Simple sequence repeat) được gọi bởi các khoa học gia di truyền ngành thực vật; hay còn gọi là Microsatellite polymorphism bởi các nhà khảo nghiệm pháp y. SSR thường dùng trong chỉ dấu DNA để xác định tộc hệ gần xa hay cha con và cũng dùng xác định thủ phạm hình sự.
- VNTR (Variable number tandem repeat). Tandem repeat (song song lập lại) thường thấy trên DNA khi một hay nhiều nucleotide được lập lại và chúng nằm kề nhau (Hình 3). VNTR. là vị trí của một trình tự nucleotide ngắn song song lập lại trong hệ gen. Chiều dài của trình tự này biến thiên tùy người, và được di truyền nên VNTR dùng để xác định tính cha con, hay căn cước cá nhân. VNR cũng hữu ích trong nghiên cứu di truyền, sinh học, pháp y và chỉ dấu DNA.
 

Hình 3. Vị trí tandem repeat với mỗi đơn vị có 8 cặp base AAACTGGG (hình trên, mỗi đơn vị tandem repeat đóng trong khung). Hình dưới, 3 tandem repeat đứng kề nhau trên dây nhiễm thể.
- STR (Short tandem repeat) là một trong các phương pháp hữu dụng nhất trong ngành sinh học phân tử, thường dùng để so sánh vị trí trên DNA của hai hay nhiều mẫu nghiệm. Một STR gồm một đơn vị có 2 tới 13 nucleotide song song lập lại hàng trăm lần thành một giãi dài trên sợi DNA.
- SNP (Single nucleotide polymorphism) là một biến thiên của trình tự DNA, theo đó chỉ cần một nucleotide đơn độc như adenine (A), thymine (T), cystosine (C), hay guanine (G) bị biến đổi mà biến thành một cá thể khác hẳn với các thành viên trong cùng nhóm. Chính nhờ sự độc đáo DNA này nên dễ phân biệt với người (hay bệnh) khác, nên được sử dụng để định bệnh và chửa trị, cũng như trong chương trình lai tạo giống cây và thú nuôi.
- SFP (Single feature polymorphism) là một chỉ dấu di truyền mới khám phá dựa trên lai tạo giữa DNA hay cRNA với oligonucleotide. Đã áp dụng tìm gen tốt ở lúa, lúa mì, đậu nành, cà chua, v.v.
- DArT (Diversity Arrays Technology) là tên của một kỹ thuật sử dụng trong ngành đánh-dấu-phân-tử để đánh dấu trình tự DNA để phân tích di truyền. DarT khám phá sự hiện diện hay thiếu sót các đoạn DNA trong hệ gen, đặc biệt là khám phá ở cây đa bội.
- RAPD (Random amplification of polymorphic DNA) dựa trên chuỗi phản ứng polymerase để đánh dấu DNA. Kỹ thuật tương đối giản dị, ít tốn kém,nhanh chóng cho kết quả, thường áp dụng vẻ bản đồ gen, khoa di truyền tiến hóa, lai tạo động vật và thực vật.
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÁNH
Wikipedia. Molecular marker. https://en.wikipedia.org/wiki/Molecular_marker
 
Wikipedia. Genetic marker.https://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_marker
 
Wikipedia. Marker-assisted selection., Marker-aided selection (MAS). https://en.wikipedia.org/wiki/Marker-assisted_selection
 
National Human Genome Research Institute (2016). An Overview of the Human Genome Project https://www.genome.gov/12011238/an-overview-of-the-human-genome-project/ 
 
(Xem tiếp phần 3). Kỹ thuật chuyển gen